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26

2024

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04

生航生物:转染试剂操作注意事项

作者:


外源基因进入细胞主要有物理介导、化学介导、生物介导。目前市面上比较常见的就是化学介导中的阳离子聚合物转染法和脂质体转染法。下面就从这两种常见方法简单介绍操作注意事项。

以 24 孔板为例,阳离子聚合物转染DNA步骤如下 

1、准备健康的细胞:刚复苏的细胞传代3–4次,使得细胞从解冻过程中恢复过来,并恢复正常的生长速度,通过显微镜观察细胞使用台盼蓝染色检测细胞活率,细胞活率保持在90%以上。在汇合率达到90%之前对细胞进行传代。

2、细胞接种: 每孔接种 0.5~1.0×105个细胞,细胞培养 12~24 小时,使转染时细胞密度达到70%-90%融合度

3、质粒稀释: 将 0.4µg 质粒稀释于 Opti-MEM 培养基中,终体积 10µL

4、 复合物制备: 按比例取适量 BC-DNA 稀释于 Opti-MEM 培养基中, 终体积 10µL,室温孵育 5 分钟后与质粒稀释液混匀

5、 室温静置 20 分钟

6、 每孔 20µL 复合物加入细胞培养板中,混匀,37℃培养 18~48 小时后检测基因表达,无需更换培养基

操作注意事项

1、细胞密度以及细胞状态,密度过低会影响转染效率,细胞状态过差转染效果也会不佳。

2、一般在转染24-72h,靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的,24-48h后即可进行靶基因表达的检测实验。转染48~72h后可检测蛋白表达,如用于重组蛋白、抗体生产等。以siRNA为例,siRNA转染后,在mRNA水平下降后,接下来才会有蛋白水平的下降,一般来说,转染后48-72h进行蛋白检测通常会得到较好的结果。

3、转染时不加血清是防止血清的干扰作用,转染后可适时加入,补充营养。加入过早会引起未转染细胞的优势生长,过晚会引起较多细胞死亡。可实时观察1/5细胞变圆的时候加入血清。尽管有些转染试剂号称不需要换液,也能取得不错的效果,但是为了使细胞培养的环境更好,建议在转染后6小时左右换有血清的培养基可能会更好。

 

脂质体法瞬时转染

1、 转染试剂的准备:将400ul去核酸酶水加入管中,震荡10秒钟,溶解脂状物。震荡后将试剂放在-20℃保存,使用前还需震荡。

2、选择合适的混合比例(1:1-1:2/脂质体体积:DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的表达基因质粒的DNA,震荡后在加入合适体积的转染试剂,再次震荡。

3、 将混合液在室温放置10-15min。吸去培养瓶中的培养基,用PBS或者无血清培养基清洗一次。加入混合液,将细胞放回培养箱中培养一个小时。到时后,根据细胞种类决定是否移除混合液,之后加入完全培养基继续培养24-48h。

4、 在转染后24h,观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。进行细胞传代,按照免疫染色合适的密度将细胞重新加入培养皿中。

5、 在正常条件下培养24h后按照染色要求条件固定。转染条件可根据实验要求改进

 

操作注意事项

1、一款好的转染试剂,要具有较高的转染效率,较低的细胞毒性和较合适的价格。现在市面上的转染试剂良莠不齐,选择时要根据需要转染的细胞系特性选择。

2、质粒的形态与大小对转染效率也有影响,超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多,特别是瞬时转染。质粒太大了转染会困难一些。用于转染的质粒DNA必须无蛋白质,无RNA和其他化学物质的污染,应确保质粒OD值A260/A280 在1.8~2.0之间。如果DNA不纯,如带少量的盐离子,蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。

3、细胞密度也影响转染效率,转染当日的细胞密度以70-90%(贴壁细胞)或2×106-4×106cells/ml(悬浮细胞)为宜,最好在转染前4h换一次新鲜培养液。

4、抗生素是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒,但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性,使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性,导致转染效率降低。

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