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03

2024

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04

生航生物:细胞培养攻略——HK-2

作者:


细胞介绍

HK-2细胞属源于正常肾的近曲小管细胞,通过导入HPV-16 E6/E7基因而获得永生化。将含有HPV-16 E6/E7基因的重组的逆转录病毒载体pLXSN 16 E6/E7转染外生包装细胞Psi-2;Psi-2细胞产生的病毒再去感染兼嗜性包装细胞系PA317,最后将PA317细胞产生的病毒颗粒导入正常的肾皮质近曲小管细胞。尽管pLXSN 16 E6/E7中含有新霉素抗性,但未用G418筛选转导克隆。Southern和FISH分析显示,HK-2细胞来源于单克隆。PCR检测证实,HK-2细胞基因组中含有E6/E7基因。

 

常见问题

1、出现拉丝

细胞伸出细长的丝有两种情况:

第一种情况是细胞迁移造成的,细胞在培养皿上并不是静态的,也会出现迁移。迁移时细胞的一部分滞留在原处,迁移的过程中会拉出一条细长的丝。这种情况下拉丝的细胞占少数,细胞整体的生长状态是正常的,不用特殊处理。

第二种情况是营养不良,拉丝的细胞占大多数,同时细胞生长缓慢,此时可以提高血清比例(不超过20%)或添加5 ng/mL EGF。

2、形态发生变化

正常的HK-2呈铺路石状生长,如果细胞呈镰刀状或不规则状(如下图),可能是因为培养环境发生了较大的改变,比如从有血清到无血清的转换,此时换回原来的培养条件细胞可逐渐恢复;如果细胞变得细长,这时候可能是营养不良。

3、生长缓慢

在标准培养条件RPMI-1640+10% FBS+1% P/S,以及1:3传代条件下,HK-2的传代周期约为3天;

当细胞生长缓慢,一周无法传代时,需要考虑培养基特别是血清是否合适;

选择合适的培养基及血清,同时加大细胞接种密度可以改善;

血清质量差异可能引起细胞状态变化,建议选用高质量的胎牛血清。

4、出现空泡

空泡问题需要结合生长速度和形态来看:如果生长速度和形态正常,空泡可能是正常的细胞活动,传代后空泡即可减轻。

如果生长较慢,形态异常,空泡可能是自噬行为,可加大血清比例(不超过20%)或更换血清品牌改善细胞状态。

培养基选择:

HK-2最初建系使用无血清培养,众多文献以及实践证明MEM、DMEM或DMEM/F12添加10%胎牛血清的条件下,HK-2也能良好生长。但胎牛血清的质量是关键,胎牛血清品质越高,HK-2状态越好。

若使用无血清培养基培养,需要使用多聚赖氨酸或者明胶包被培养瓶,以促使贴壁。

 

【细胞复苏】

1、取出1mL冻存管后,迅速放入37℃水浴锅中不断摇晃使其解冻,直至冻存管中无结晶(此过程尽量在2min内完成);

2、准备15mL离心管,加入2-6mL完培,将冻存管中的细胞悬液移至离心管,1000 rpm离心3~5min;(比较难养的细胞可适量增加离心管中的完培)

3、吸弃上清,用新鲜培养基重悬细胞,接种至无菌的培养器皿中,轻晃动混匀后放入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

注:复苏第二天若细胞状态较好,但漂浮碎片较多可做换液处理;

复苏的细胞需要时间恢复状态,当复苏好后密度低于80%时,2天内暂时不要换液,细胞生长状态恢复后再进行后续传代等操作;

【细胞传代】

当细胞汇合度达到80%-90%,即可传代培养。

收集细胞:贴壁细胞可以参考以下方法

1、吸去培养液,加入不含钙镁的PBS,轻轻润洗瓶底1-2次,吸弃PBS;

2、加入0.25%胰酶-EDTA消化液(T25瓶1-2mL,T75瓶2-3mL),铺匀瓶底放入培养箱中消化1-2min;(部分细胞贴壁较牢,可采用分步消化:将消化下来的细胞转移至离心管终止,在培养瓶中加入胰酶继续消化,直至大部分细胞脱落)

3、倒置显微镜下观察大部分细胞变圆脱落,迅速加入完全培养基终止消化,完培与胰酶比例为2:1;

4、轻轻吹打细胞后吸出转移至离心管中。半贴壁半悬浮细胞需先收集悬液至离心管再参考贴壁细胞操作。

离心:收集好的细胞在1000rpm条件下离心3~5min,离心好后弃除上清液。

接种:准备好新的培养瓶并添加适量完全培养基,在离心管加入1-2mL完全培养基重悬吹打均匀,初次传代将细胞悬液按1:2比例接种到新的培养瓶中,后续可根据细胞实际情况按1:2-1:4的比例传代;接种完成后放入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

悬浮细胞建议采用半换液传代:将培养瓶站立静置5-10min,肉眼可见细胞沉底,吸取1/2~2/3上清至离心管离心,将瓶内剩余悬液按1:2或1:3的比例转移至新的培养瓶,将离心管中的细胞重悬后放入培养瓶添加新鲜完全培养基即可。

【细胞冻存】

收集细胞参考细胞传代步骤。

冻存液重悬:细胞按照传代步骤收集细胞至离心管并计数,根据计数的密度决定细胞冻存数量,一般推荐细胞冻存密度为1×106-1×107个活细胞/管。离心后弃上清,加入配制好的冻存液重悬,分配到冻存管中,每管1mL。

冻存:将冻存管放入程序降温盒中进行梯度降温,然后放入-80℃冰箱降温,24h后将冻存管转入液氮罐中。若没有冻存盒,可于冰箱4℃放置30min,随后转移至-20℃冷冻2h,接下来将其放于-80℃超低温冰箱中过夜,最终放置于液氮中以长期保存。

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