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HEPES缓冲盐溶液(2×HeBS,7.05)

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¥ 120

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    • 100mL

所属分类:

常规溶液

常规溶液

货  号:

BL-301-100mL

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存储条件:

—20℃

有  效  期:

12个月

  • 产品描述
  • 参考文献
    • 商品名称: HEPES缓冲盐溶液(2×HeBS,7.05)
    • 商品编号: BL-301-100mL
    • 货号(表格): BL-301-100mL
    • 价格(表格): 120
    • 规格: 100mL
    • 规格(表格,必填): 100mL
    • 货期: 查询
    • 储存条件: —20℃
    • 有效期: 12个月

    【货号】 BL-301

    【规格】 100mL

    【保存】 -20℃,12个月。

    【产品简介】

    外源基因导入真核细胞的方法有很多种,如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖转染法、脂质体法、电穿孔法、显微注射法等。2×HEPES缓冲盐溶液主要用于磷酸钙转染,其主要成分为HEPES,HEPES是一种非离子两性缓冲剂,能有效控制pH在6.8~8.2范围,尤其在pH7.2~7.4具有较好的缓冲能力,终浓度一般为10~50mmol/L,培养液内含20mmol/L HEPES即可达到较好的缓冲能力。

    HEPES缓冲盐溶液(2×HeBS)是一种常用的细胞转染溶液,主要由HEPES、氯化钠、磷酸盐等组成,其最适pH值为7.05~7.12,经过滤除菌处理。影响磷酸钙转染效率的因素主要有沉淀中DNA含量、DNA在细胞上停留的时间、休克时间。2×HeBS要求DNA浓度在10~50μg为宜,Hela、BALB等细胞沉淀放置16h,CHO、DUKX、BⅡ等细胞可以通过甘油、DMSO进行热休克处理以提高转染效率。

    【自备材料】

    1、胰蛋白酶消化液

    2、PBS

    3、无菌水

    4、CaCl2溶液

    5、甘油或DMSO

    6、筛选药物

     

    【使用方法】

    1、在转染前24h用蛋白酶消化培养细胞,取适量数期细胞转移至新的培养器皿中,使细胞在转染时生长状态良好。

    2、在加入DNA之前2~4h,按9mL/10cm培养皿的比例加入完全培养液,置于37℃ 5% CO2培养箱培养。

    3、取适量乙醇沉淀的DNA溶解于450μl无菌水中,加入50μl 2.5M CaCl2,并充分混匀,使Ca2+终浓度达到0.25M。

    4、用移液器一边吹打2×HeBS,一边逐滴加入配制好的DNA/CaCl2溶液(操作应迅速,一般在30~60s),并剧烈振荡5s,室温下静置20~30min以形成沉淀。

    5、取沉淀均匀加入到培养皿细胞中,轻轻晃动使沉淀于培养液充分混匀,置于37℃ 5% CO2培养箱培养4~16h。如果培养细胞为CHO、DUKX等,可以DMSO或甘油进行休克处理,转染效率会大大增加。即培养4~6h后,用2ml含10%甘油或20% DMSO的完全培养液替换当前培养液,室温下静置3min,加5ml PBS摇动混匀。

    6、去除培养液,用PBS清洗细胞2次,加入5~10mL完全培养液继续培养。

    7、对于瞬时转染,在转染的不同时间点内收集细胞并检测,一般时间多控制在12~60h以内。

    8、对于稳定转染,转染后在非选择性培养液培养18~48h,一般时间多控制在24~36h,以便外源基因表达。

    9、用胰蛋白酶消化细胞并传代,更换适当的选择培养液继续培养,每2~4d更换一次选择培养液,一般10~14d会出现目的细胞克隆。

    【注意事项】

    1、注意无菌操作,尽量避免污染。

    2、对于瞬时转染,可以不用乙醇沉淀的DNA。

    3、休克处理某些细胞系会使转染效率大大提高,但应注意甘油暴露过久易导致细胞死亡。

    4、转染12~24h后,可以加入终浓度为10mmol/L的丁酸钠溶液,可以提高病毒滴度。

    5、该试剂用于转染时应检测其转染效率,好的转染效率应介于30~60%之间。

    6、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

关键词:

HEPES缓冲盐溶液(2×HeBS,7.05)

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