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25

2023

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09

血凝实验操作详解

作者:


红细胞凝集指红细胞凝集的现象。凝集的种类可以分为由病毒而引起的凝集,最先是G.H.Hirst发现流感病毒能使鸡的红细胞发生凝集,其后又陆续发现其它各种病毒也能引起同样的红细胞凝集反应和由红细胞表面的抗原或抗体与外界物质反应引起的凝集;实验室较常进行的血凝实验指的是病毒引起的红细胞凝集现象。

 

1、实验原理

某些病毒和病毒表面带有的血凝素会引起人或某些动物的红细胞发生凝集现象即红细胞表面存在着对各种病毒的受体,病毒与受体结合,以红细胞为桥梁的结果而引起凝集。利用此反应可以进行病毒的定性和定量。另外,如果存在抗病毒的抗体时,则由病毒引起的凝集作用将被抑制,所以可用于抗病毒抗体的检出。

不同病毒产生血凝的原理并不相同。有些凝集的发生是因为病毒的血凝素与红细胞表面受体结合吸附发生,有些是由于病毒的产物等等。病毒血凝的类型也分为不同的几种。例如:

可逆转型:即红细胞与血凝素的结合是可逆转的,红细胞可释放吸附于表面的血凝素,也可再次发生凝集;

不可逆性:血凝素与病毒结合紧密,不能分开。这种情况的血凝无法逆转,当病毒从红细胞表面释放时,红细胞表面受体已被破坏,无法再凝集;

严格型:有些病毒和血凝素对红细胞凝集的条件严苛,需要对特定物种红细胞,或者特定年龄性别动物的红细胞才可发生凝集。

 

2、实验步骤

(一)材料准备:

器材:96孔板,微量移液器(配有滴头)。

试剂:配制阿氏液制作红细胞悬液,pH7.2的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS),高致病性禽流感病毒血凝素分型抗原,标准分型血清,阴性血清。

(二)实验操作

1、选择 96 孔板,如使用鸡或火鸡红细胞,应选 V 型微量血凝板;如使用豚鼠或人 O 型红细胞,应选 U 型微量血凝板。将微量板横向放置:垂直方向称列,如孔 A1~H1 称为第一列;平行方向称行,如 A1~A12 称为 A 行。标记好待检病毒的实验室编号及加样顺序。

2、病毒倍比稀释,首先加 PBS取8道加样器于加样槽中吸取50μl PBS加入微量板的第二列,依次加入50ul PBS 直至最后一列。随后加入待检病毒使用单道加样器吸取100μl待检病毒液,加入已标记好的微量板的第一列相对应的孔内。最后的孔内加 100ulPBS 作为红细胞对照。再用8道加样器从第一列的各孔分别取 50ul 病毒液,加入到第二列的相应的各孔,混匀数次。依次从微量板的第二列至第十二列做二倍系列稀释。最后一列每孔弃去 50μl 液体。

3、病毒稀释好后加鸡红细胞:用8 道加样器于加样槽中吸取50μl红细胞悬液。每孔加入50μl1%的红细胞悬液,轻弹微量板,使红细胞与病毒充分混合。

4、混匀后室温静止。

 

结果判定

判读结果时,将血凝板倾斜45°,进行观察。

++++:红细胞全部凝集,均匀铺于孔底,100%红细胞凝集;

+++:红细胞的凝集情况基本与上述相同,但孔底有大圈;

++:红细胞在孔底形成中等圈,四周有小凝块;

+:红细胞在孔底形成小圆点,四周有少许凝结块;

-:红细胞在孔底呈现小圆点,边缘光滑整齐,完全不凝集。

其中,使红细胞完全凝集(++++)时的抗原最高稀释度,作为该抗原的血凝效价,单位为1个血凝单位HAU。在进行结果判读时,需要对照组表现为完全不凝集(-),判读结果才算有效。

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