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28
2023
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06
HE染色
作者：
HE染色法
图 1 产品效果图
苏木素-伊红染色简称HE染色，是石蜡切片技术里常用的染色法，在病理学常规制片中应用最为广泛的染色方法。在病理诊断、教学和科研工作中，常用其对正常组织和病变组织进行形态结构观察。对于确定或鉴别病变组织、细胞中出现的某些异常物质与特殊成分，而需要采用的特殊染色方法，酶组织化学方法、免疫组织化学方法等也均是在观察HE染色组织切片的基础上进行的。在HE染色的组织切片中，细胞核呈蓝色，细胞浆呈红色，二者形成鲜明的对比，易于观察分析。
实验原理
染色原理
细胞浆中主要成分为蛋白质，伊红是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，可与蛋白质的氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗料等被感染成不同程度的红色或粉红色。
细胞核内的染色质主要是脱氧核糖核酸它的双螺旋结构中，两边链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。
盐酸乙醇分化
苏木精染色完成后必须用盐酸乙醇分化，这样可以去除过深的核着色及胞浆上多余的苏木精颜色，使切片对比更加鲜明。
返蓝
苏木素在酸性溶液呈红色，碱性溶液呈蓝色，所以一般用氨水稀释返蓝，也可以用流水冲洗10min，这样可以去除切片上残留的盐酸，以保证切片长期保存不褪色。
透明
透明过二甲苯本意是脱水，但在这一过程中，因水分被溶剂（如二甲苯）取代，其折射指数接近于组织蛋白的折光指数，组织块变得透亮，因此称之为透明。
实验步骤
整个染色过程包括五个内容：脱蜡，染色，脱水，透明，封固。
脱蜡
从温箱中取出烤干的切片，立即投入二甲苯中脱蜡，脱蜡时间长短取决于石蜡是不彻底溶解。气温低可延长时间，气温高可适当缩短时间或在温箱中加速脱蜡。移入无水酒精(100%)(二瓶)中约2min；移入90%酒精中(二瓶)约2min；移入80%酒精中(二瓶)约2min。移入70%酒精中约2min。移入水中洗去酒精约2～3min。移入蒸馏水中约2min。
染色
移入苏木素中浸染8～15min，一般以稍深染为宜；移入水中，洗去苏木素和浮色，约1～2min。移入分化液(1%盐酸酒精)中，分化几秒至30秒钟，使切片褪色至淡兰红色即可。分化的作用，可使细胞浆兰色脱去，而细胞核更加清晰，鲜丽，分化不足时，胞浆带蓝，胞核过染，分化过度时，胞核太淡，难以辩认，可再退回苏木素染液， 延长一定时间。移入流水中，洗涤30～60min，使组织呈鲜蓝色或天蓝色。移入伊红液中，浸染2～5min，如着染缓慢 ， 可在伊红液中加入冰醋酸 (100ml伊红液加1～2滴冰醋酸)以助染。移入水中，洗去伊红浮液，并用纱布擦净玻片上的多余染料。
脱水
吸去玻片上的水分后多入80%酒精中，(二瓶)脱水，约1～2min，如在酒精中褪色很快时，可迅速移入90%酒精或返回伊红液中复染。移入90%酒精中(二瓶)脱水，约2～4min。移入无水酒精(100%酒精)(二瓶)彻底脱水，约4～8min。
透明
移入二甲苯Ⅰ中透明3～5min；移入二甲苯Ⅱ中透明5～10min。
封固
用树胶封固，先从二甲苯Ⅱ中取出切片，将组织外围的二甲苯迅速擦去，在滴上一滴树胶于组织片上，然后取干净的盖玻片，仔细加在封固剂上，慢慢压平， 使盖片位置适中。切片封固后，放在温箱中烤干，或平置凉干后装盒。
染色效果评定：
1、细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。
2、细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。
3、着色情况与组织或细胞的种类有关，也随其生活周期及病理变化而改变。例如，细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱，当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。胶原纤维在老化和出现透明变性时，伊红着色由浅变深。
4、HE染色评定标准：
（1）切片完整，厚度3-6微米，厚薄均匀，无皱褶无刀痕；
（2）染色核浆分明，红蓝适度，透明洁净，封裱美观。
图 2苏木素-伊红染色效果图
常见问题及注意事项
注意事项
- 组织切片的脱蜡步骤应彻底，否则无论进行那种染色都会发生困难。
- 空气中的灰尘和污染物会对实验产生不利影响，因此在染色过程中，需要避免将切片长时间暴露在空气中，并保持实验室的清洁和卫生。
- 染色时调节PH值很重要。组织切片在染色前必须在适当的缓冲液中浸泡，在染色期间PH值应始终稳定。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。
- 分化十分重要。分化步骤的准确也是染色成败的关键，若分化失当则必然引起染色不匀或过淡，过深等现象，因此分化后一定要镜检，观察胞核是否清晰，胞浆呈淡白色。否则需再次分化，不然一旦复染后，组织会呈紫蓝色即“蓝盖红”现象。
- 在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。
- 二甲苯在 HE 染色中有脱蜡、透明的作用。二甲苯脱蜡的好坏主要取决于切片在二甲苯内放置的时间和脱蜡时的温度以及二甲苯的使用次数。染好的切片必须经过透明，有利于显微镜观察，同时并为封片起到了桥梁作用。
- 伊红有水溶的和醇溶的，如果用的是水溶的，应该在脱水前进行染色，如果是醇溶的，应使用与溶解伊红等浓度的酒精开始脱水。
常见问题
- 切片在脱蜡后出现大片白色斑点
分析：可能原因是玻片在脱蜡前没有充分烤干；二甲苯使用时间过长；切片在二甲苯停留时间不足。
建议：如果出现烘干不足的现象，切片会容易脱落，一般无法补救；如果白色斑点是由于切片在二甲苯停留时间不足造成，或使用的二甲苯过久，切片则需退回到二甲苯操作步骤，使其停留时间相对长些，或更换二甲苯，重新染色即可。
- 结构不清晰或者模糊
分析：可能是切片质量问题或者染色条件不佳。首先排查切片质量，染色条件，若不是这两个原因，则可能是透明化处理切片后没有完全处理异物或者固定较差。
建议：如果切片呈云雾状是因为染色后脱水不彻底，切片内含有水分所致。脱去盖玻片，用二甲苯洗去树胶，再用乙醇洗去二甲苯，重新脱水透明。
- 苏木精染色太淡
分析：可能原因切片苏木精染色时间不足；苏木精染色液过度氧化丧失染色能力；分化处理时间过长，若果是骨组织细胞核暗淡大部分都是由于脱钙过度。
建议：如果是染色时间不足则切片重新染色，如果切片在组织固定液里时间过长，细胞核染色能力将减弱，需增加苏木精染色时间，或用一些办法增加组织嗜碱性，已改善细胞核着色；若果苏木精过度氧化则跟换苏木精染色液重新染色。
- 切片细胞核棕色
分析：苏木精染色液过度氧化和切片在苏木精染液染色后返蓝不足。
建议：苏木精染色液过度氧化可以在每次染色前检查染液染色能力，如果氧化过度及时更换。返蓝不足可以用流水、温水或弱碱溶液在苏木精染色后，给切片足够的返蓝时间。
- 伊红着色淡
分析：伊红染液的PH过大；苏木精染液残留过多；切片过薄；脱水处理时间过长。
建议：检查伊红染液PH值，调节至4-5之间。可以使伊红染色着色艳丽。确保每次蓝化操作后，使用弱碱性溶液充分洗去，使得玻片上没有残留的染液。检查切片厚度。脱水时不要让切片在低浓度乙醇中停留过久，因为伊红会被含水多的低浓度乙醇分化掉。
- 切片中出现类似色素样的点状结晶和黑色光滑的细胞核
分析：切片封片前放置在空气中时间太长，以至于二甲苯挥发切片干燥所致。
建议：移去组织切片上的盖玻片和封固剂，重新处理。将切片水洗数分钟，然后重新脱水、透明、封固。封片过程中要保持组织切片的轻度湿润，尽量不要让其干燥。
- 显微镜下切片内有大量水珠
分析：切片经梯度乙醇处理后没有完全脱水，导致二甲苯透明中性树胶封固后残留大量水分。
建议：移去盖玻片，用二甲苯溶解封固剂如中性树胶。将切片置入新鲜的无水乙醇换几道。待切片重新脱水完全后，用新二甲苯透明，中性树胶封固。所有用于脱水和透明的液体，在使用一定时间以后，应及时更换。
- 切片中出现类似色素样的点状结晶和黑色光滑的细胞核
分析：切片封片前放置在空气中时间太长，以至于二甲苯挥发切片干燥所致。
建议：移去组织切片上的盖玻片和封固剂，重新处理。将切片水洗数分钟，然后重新脱水、透明、封固。封片过程中要保持组织切片的轻度湿润，尽量不要让其干燥。
- 细胞核灰蓝
分析：（1）组织处理温度过高、过热，在石蜡停留的时间过长；（2）固定时间太短，接下来就直接在高浓度的乙醇中行脱水处理。
建议：理论上来说，加热处理仅在组织浸蜡步骤才使用，组织不能在热的蜡液中停留过长时间。如果由于某些原因不能进行下步包埋处理，完成浸蜡处理后的组织，可将组织连同塑料包埋盒一并放置在室温空气中，冷却凝固，以备包埋。待需要包埋时再重新加温直至石蜡融化即可。组织在处理前必须确保固定良好，脱水能从低浓度的乙醇开始。
- 切片中出现蓝黑色沉淀物
分析：苏木精染色液中的金属膜，黏附在玻片上。
建议：每天染色前仔细过滤苏木精染色液，或建议使用半氧化苏木精染色液，如 Gill苏木精染色液，可以避免过多的金属膜产生。
- 切片从脱蜡的二甲苯经过梯度乙醇进入水溶液时，水和玻片呈现乳白色混浊改变
分析：用于脱蜡的二甲苯没有被乙醇洗干净。
建议：更换洗涤二甲苯的乙醇液体，把切片重新放回无水乙醇，脱去玻片上的水分。
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